广州九州体育娱乐生物科技有限公司

实验技巧

实验技巧

滤膜法与固定底物酶底物法测定地表水中粪大肠菌群的比较研究

发布时间:2017-05-15       点击数:1495

粪大肠菌群(耐热大肠菌群)是总大肠菌群中的一部分,主要来自粪便。用提高培养温度的方法,造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件,使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群,从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。[1]

 

粪大肠菌群在每个月的地表水例行监测中任务量较大,采用更快速简便、精确的检测方法十分必要。目前国内地表水的常规监测中,粪大肠菌群(耐热大肠菌群)的主要检测方法是多管发酵法和滤膜法,其中,多管发酵法因其检测周期长,步骤冗长复杂,假阳性等不利因素,已经面临淘汰,故滤膜法是现行地表水监测方法中比较快速的检测方法;而国外则以固定底物酶底物法为主,该方法是一种新型酶技术检测方法,其检测的高效性受到许多分析人员的青睐。本文通过比较滤膜法与固定底物酶底物法测定地表水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)的结果和方法,讨论固定底物酶底物法用于监测地表水中粪大肠菌群的可行性。


1 试验部分

1.1 仪器及试剂

1.1.1 仪器 CL-32L 高压全自动灭菌锅,LRH-280 生化培养箱,IDEXX程控定量封口机,移液器等。

1.1.2 试剂 MFC 培养基,科立得TM(Colilert?)试剂。


1.2 方法原理

1.2.1 滤膜法

滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜(孔径 0.45 ?m)的滤器中,经过抽滤,细菌即被截留在膜上,然后将滤膜贴于 M-FC培养基上,44.5 ℃温度下进行培养,计数滤膜上生长的此特征的菌落数,计算出每 1 L水样中含有粪大肠菌群数。

1.2.2  固定底物酶底物法

根据大肠菌群细菌能产生特异性的 β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase) 分解 MMO-MUG 培养基中的色原底物ONPG(Ortho-nitrophenyl-β-D-glucuronide)使培养液呈黄色,以及大肠埃希氏菌产生特异性的β-葡萄糖酸酶(β-glucuronidase)分解MMO-MUG培养基中的荧光底物MUG(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucronide)使培养液在波长 366 nm 紫外光下产生荧光的原理,来判断水样中是否含大肠菌群、粪大肠菌群(耐热大肠菌群)及大肠埃希氏菌。[2]

 

1.3  样品来源水样来源于受污染的地表水,按照《水和废水监测分析方法》

水样来源于受污染的地表水,按照《水和废水监测分析方法》(第四版)的规定采集,并于 0~4 ℃低温避光保存,6 h 内进行分析。


1.4 试验方法

本试验分别对 40 个地表水样品同时进行滤膜法和固定底物酶底物法检测,根据数据判断两种方法是否具有可比性。


1.5 试验步骤

1.5.1 滤膜法

对每个样品分别取 10 mL、1 mL、0.1 mL 的水样量(即做 3个稀释度的分析),抽滤,将滤膜置于 MFC 培养基表面,紧密盖好培养皿后,置于44.5±0.5 ℃的恒温培养箱培养 24±2h;选取培养基上呈蓝色或蓝绿色的特征菌落计数,然后选择生长有理想菌落数 20~60 个(总菌落数不得超过 200 个)的稀释度去计算每 1 L水样中的粪大肠菌群数。


1.5.2固定底物酶底物法

用100 mL 的无菌取样瓶量取 100 mL 水样,加入科立得TM(Colilert?)试剂,混摇均匀使之完全溶解,将水样全部倒入 97孔无菌定量盘内,以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡,用程控定量封口机,放入 44.5±0.2 ℃恒温培养箱中培养 24 h 后,计算有黄色反应的孔穴数,对照 MPN 表查出其代表的粪大肠菌群最可能数。


2 结果与讨论

2.1 试验结果及数据分析

2.1.1 试验结果

本次试验的地表水样品共 40 个,由于其中 3 个样品的结果大于 24196 个/L(即 97 孔定量盘 MPN 表的最大值),难于对数据进行比较,故此次试验采用其余 37 个样品的结果进行比对分析,两种方法的检测结果见图 1。

 


图 1  两种方法的粪大肠菌群检测结果

 

2.1.2 数据分析                

2.1.2 数据分析
运用软件 Excel2003,对两种方法检测的粪大肠菌群结果进行配对 t 检验[3],为了使两组数据呈正态分布,现对数据进行对数处理后再进行 t 检验,结果见表1。


由表 1 可见,泊松相关系数为 0.636,属强相关(系数越趋于 1,相关性越好),说明两组数据的相关性很好;检验统计量 t=0.515,P=0.610>0.05,说明两组数据无统计学意义上的显著性差异,可认为滤膜法与固定底物酶底物法的试验结果具有可比性。


2.2 讨论

(1)在试验结果方面,通过配对 t 检验,此次试验分析得到的两组数据无统计学意义上的显著性差异,说明两种方法的检测结果具有可比性。

 

(2)在实验的前期准备方面,滤膜法需要配制培养基和对大量的玻璃器皿进行灭菌,光是前期的准备时间就需要 3~6 h,而固定底物酶底物法则不需要前期准备,只是需要对封口机进行提前预热,一般需要 20 min 左右,这种优势在应急监测中尤为明显。

 

(3)在实验操作方面,虽然滤膜法相对于多管发酵法来说,实验操作已经简便了很多,但相对于固定底物酶底物法来说,滤膜法的操作还是相对比较繁琐,需要分析人员有大量的实验经历才能提高工作效率;而固定底物酶底物法的操作步骤则比较简单,无需过多经验就能很顺利地操作实验,同时也由于步骤简单,在实验过程中也大大减少了人为污染。

 

(4)在检测时间方面,滤膜法一般是 24 h,如需确认试验,检测时间则需要 48 h,而固定底物酶底物法的检测时间也是 18~24 h,但无需确认试验。一般来说,两种方法的检测时间差别不大,若算上实验前期准备的时间和实验后清理器皿的时间,则是滤膜法花费的时间更多。


(5)在结果判断方面,滤膜法在挑选典型菌落读数时,需要实验人员有良好的微生物知识,必要时还要对可疑菌落进行确认试验,而固定底物酶底物法读数时对实验员的专业知识要求不高,而且无需进行确认试验。


3. 结论

两种方法的检测结果具有可比性,说明固定底物酶底物法可用于地表水中粪大肠菌群的监测。固定底物酶底物法具有操作简单、检测周期短,前期准备工作少,对试验条件和人员要求低,无需确认试验,易于推广等优点,已经被世界各国的国家及地方实验室和世界各组织机构如APHAAWWAWEFAOACBWAEBWAWHO 认可,在我国已有 40 余家供水公司、30 余家疾病预防控制中心、30 余家环境监测中心及水文站应用。因此,固定底物酶底物法替代传统的多管发酵法和滤膜法是发展的趋势。


参考文献
[1]《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行)》(HJ/T347-2007)[S].国家环境保护总局发布,2007.


[2]高瑞坤,汤琳,付强.水中粪大肠菌群快速检测方法-固定底物酶底物法与多管发酵法的比较[J].中国环境监测,2008,24(4):39-41.


[3]陈雄新,曾建一,陈勇.Excel 在 t 检验中的实用技巧[J].实用预防医学,2006,13(1):202-205.



扫一扫    关注【食安实汇】

【食安实汇】公众号由广州九州体育娱乐生物科技有限公司运营。九州体育娱乐科技致力于引进食品与环境安全的检测新技术。