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实验技巧

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水中微生物能力验证菌落总数的方法研究

发布时间:2017-05-15       点击数:2359

【摘要】现时检测水中菌落总数的方法有国家标准的平皿计数法和地方标准的复合酶底物法,通过能力验证和实验室间比对,科学分析少量数据并得出结果,两种方法的结果均接近样品真值,其中复合酶底物法呈现的结果更准确,不需要在无菌条件下操作,在实验室经验成本条件允许下可推广该技术。使用平皿计数法比较两种不同形态的菌种,结果得出当菌种体积越小、体液越深,在培养的时候越容易分辨个数,得出的结果越准确。




1 引言

菌落总数作为判定水中被细菌污染程度的标志,长期作为常规指标观察水体中细菌的性质和繁殖动态,对水质卫生标准提供科学依据。


在不同环境、不同操作人员、不同使用器皿的条件下,菌落总数的结果可能会受到影响,因此我们需要进行能力验证,去查找在检验中是否存在问题,挖掘不足之处进行改进。国际间的微生物能力验证十分成熟,有着十几年的经验成果;我国近年来引进了该系列能力验证,包括菌落总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、埃希氏菌群、甲第鞭毛虫、隐孢子虫等共6项微生物实验室间能力验证。以上能力验证均被国际认可,通过验证的实验室及操作人员可获颁证书;存在不足的实验室,有专业的团队协助发现问题,改进实验室条件,以达到符合国家规定的实验标准。


2 材料与方法

2.1 培养基和试剂

适用于《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》GB/T 5750.12-2006 1.1平皿法计数中的培养基,广东环凯微生物科技有限公司生产的营养琼脂培养基。

适用于《水中菌落总数符合酶底物检测方法》DB44/T 1163-2013中的培养基套装,包含SimPalte 100mL瓶装无菌培养基和84孔穴样品盘。


2.2 实验仪器

恒温生化培养箱、高压灭菌锅、便携式紫外灯


2.3 实验方法及原理

2.3.1 样品处理

将样品冻存管从冰箱中取出,于室温下平衡10至15分钟。将100毫升无菌水倒入无菌取样瓶中。打开样品冻存管,将有颜色的圆形胶盘无菌操作转移到装有无菌水的取样瓶中,充分振荡后静置10至15分钟,直至圆形胶盘完全溶解,得到待检测的样品原液。

盲样需再取90毫升无菌水倒入另一无菌取样瓶,取10毫升样品原液转移到90毫升无菌水中,充分混合,得到待检测的10倍稀释度样品。

从样品接触无菌水到完成检测,全过程在45分钟内完成。


2.3.2 平皿计数法

灭菌移液管吸取1毫升样品,注入灭菌平皿中,倾注月15毫升已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿,使样品与培养基充分混匀。凝固后倒置放入36℃±1℃培养箱内,培养48小时。

质控样品原液、盲样样品原液、盲样10倍稀释样品等各做5个平行接种,合共3组样品。同时对营养琼脂和1毫升无菌水各做1个空白对照。


2.3.3 复合酶底物法

灭菌移液管吸取1毫升样品和9毫升培养基加入到样品盘中心,盖上样品盘盖子,轻轻转动样品盘将液体分配到每个孔穴中。然后慢慢将盘子竖起90°至120°,将多余的液体吸到样品盘中的还买上。把样品盘缓慢倒置,放入36℃±1℃培养箱内,培养48小时。

已知盲样样品原液浓度在该方法上限值738MPN/mL范围内,故只需使用原液做5个平行接种,合共1组样品。用10毫升培养基做1个培养基空白,用1毫升无菌水代替样品做1个纯水空白对照。


3 结果讨论

3.1 两个方法菌落总数生长情况

每5个平行样为一组的样品,以样品转移到平皿或样品盘的时间为排序方式,在45分钟内完成整个操作过程,4组样品中均没有出现随时间变化而有规律性的结果变化。具体结果如表1。



在检验结果的可信度时,通过质控样结果,可判断在此次实验操作过程中测量值的准确性是可信的。

在选取有效结果数值时,因每组样品的样品量较少,且微生物培养结果的允许限值跨度较大,通常在检验微生物结果时,取二倍相对偏差为合理范围,对应此次实验结果,各组样品结果均在合理范围之内,直接求得平均值得出最终结果。

在选择平皿计数法中是否稀释过的样品作为最终结果时,按照GB/T 5750.12-2006 1.1.7的要求,“首先选择平均菌落数在30~300之间者进行计算”,但是,根据实际情况,对平皿的观察与比较,盲样中的菌落形状较小、轮廓清晰、分布均匀、数量可计数,同时考虑到通过二次稀释,可能将外来菌种带到样品中造成结果偏高,故最终结果选取不经稀释的培养皿进行计数与结果上报。


3.2 质控样品与考核样品菌种大小、形状的对比

在相同的200倍显微镜放大后观察质控样和盲样菌种大小及形状,质控样品最长直径较大、整体呈椭圆形、两头较圆、菌种有透光性、浓度较高的时候培养效果容易结团连成一片;盲样最长直径是质控样的25%、整体呈尖锥形、两头较尖、菌种透光度较低、浓度较高时候培养效果清晰可辨、不容易结块结团。


4 小结

微生物比对在国内处于起步阶段,每年全国性的微生物实验室间比对规模越来越大,认可度越来越广,对实验室能力要求也越来越高。


对于平皿计数法与复合酶底物法优越性比较,平皿计数法是传统的检测方法,低成本、应用时间长、技术成熟,对操作环境的卫生条件要求高,需要在无菌室内操作;复合酶底物法是近年开法出来的新方法,操作简单,在普通的实验室内也可以进行培养,多次质控样的结果,复合酶底物法比平皿计数法更接近样品真值,但实验用的培养基培养皿等材料成本较高。


无论选取何种方法,若要做好实验室间比对,前期准备工作至关重要。对恒温培养箱48小时的恒温观察记录、对实验用具的清洁消毒、对培养基的储存与配制,还有就是多次练习提升操作速度,从而能在规定的菌种活性有效时间内多做几组平行样。


参考文献

[1] 肖剑, 李慧琴, 陈楷, 等. 食品微生物能力验证样品菌落总数检验方法 [J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 10(5): 3343-3348.


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